Příloha č. 2 k vyhlášce č. 293/1997 Sb.

Stanovení vlákniny potravy
(total dietary fiber - TDF)

Pro stanovení vlákniny potravy se použije ezymatickogravimetrická metoda uznávaná AOAC, jejímž principem je simulování působení trávících enzymů na potraviny v lidském těle. Ze vzorku se po odtučnění odstraní škrob působením alfa amylázy a amyloglukozidázy a bílkoviny působením proteáz. Zbytek tvoří vláknina a minerální látky. Pro analýzu dle této metody se používá zařízení FIBERTEC E"

Potřebné chemikálie
1.	
2.	sada enzymů firmy Merck dodávaných pod označením "Bioquant", obsahující roztoky a-amylázy, proteázy a amyloglukozidázy,
3.	etanol 95% ,
4.	etanol 78% ,
5.	fosfátový nárazníkový roztok ( 0,08 mol/1), pH 6,0, (1,4 g NaH2PO4 ( nebo 1,752 g NaH2PO4.2H2O) + 9.86 g NaH2PO4.2H2O rozpustit v 700 ml H2O, upravit pH na 6 pomocí NaOH nebo H3P04 a doplnit na 1l),
6.	vodný roztok NaOH (0,275 mol/1),
7.	vodný roztok HCL (0,325 mol/l),
8.	aceton
9.	Celite 545,
10.	petroleter,
11.	směs koncentrované. kyselin H2SO4 + H3PO4 (20 : 1 % objem),
12.	peroxid vodíku koncentrovaný 
13.	katalyzátorové tablety "1000 Special Kjeltabs S 3.5" (firma Tecator),
14.	indikátor Tashiro (0,2 g metylčerveně se rozpustí ve 100 ml etanolu (96%), 0,1 g metylenové modři se rozpustí ve 100 ml destilované vody; oba roztoky se smísí),
15.	kyselina boritá (4% vodný roztok), 
16.	hydroxid sodný (40% vodný roztok),
17.	vodný roztok H2SO4 (0.1 mol/1).

Potřebné zařízení a pomůcky
1.	
2.	analytické váhy (přesnost 0,1 mg),
3.	inkubační nádobky (dodané firmou Tecator),
4.	fitrační kelímky (skleněné kelímky s fritou - dodané firmou Tecator),
5.	sušárna,
6.	exikátor,
7.	varná vodní lázeň,
8.	vodní lázeň s třepačkou a termostatem (firma Tecator),
9.	pH metr,
10.	mikropipeta,
11.	filtrační zařízení s vodními vývěvami (firma Tecator - pod označením "FIBERTEC SYS'TEM E"),
12.	muflová pec,
13.	skleněné trubice,
14.	zařízení KJELTEC (spalovací bloky "DIGESTION SYSTEM 6 1007 Digester", destilační jednotka "KJELTER SYSTEM 1026 Distiling Unit") nebo jiné zařízení se stejnými parametry,
15.	multibyreta E 485 (Metrohm Herisau pro Tecator),
16.	hliníková fólie,
17.	mixér nebo laboratorní mlýnek,
18.	Soxhlet s chladičem,
19.	topné hnízdo.

 A. Příprava frit

Do filtračních kelímků se naváží 0.5 g CELITU 545 a kelímky se suší v sušárně při 130°C do konstantní hmotnosti (asi 1 hodinu). Uloží se exikátoru, ve kterém se uchovávají až do vlastního použití.

B. Příprava vzorku

Pevné, jemně granulované vzorky se po homogenizaci navažují přímo. Vzorky pevné nebo pevné hrubě granulované se umelou v mixéru nebo v mlýnku. Vzorky tekuté a pastovité se suší při 105 °C přes noc v sušárně případně se lyofilizují.

Je-li obsah tuku ve vzorku vyšší než 10 %, odextrahuje se tuk v Soxhletově extraktoru. Do patrony se naváží 15 g vzorku a extrahuje se 220 ml petroleteru po dobu 4 hod. Odtučněný vzorek z patrony se po odpaření rozpouštědla použije na stanovení vlákniny. Vyextrahovaný tuk se po oddestilování rozpouštědla suší v sušárně pň teplotě 105 °C do konstantní váhy. Výsledek se pak vztahuje na tukoprostou sušinu.

C. Stanovení sušiny

Sušina vzorku se stanovuje v sušárně sušením při 105 °C do konstantní váhy. Navážka vzorku je 5 - 10 g.

D. Vlastní analýza
1.	
2.	Připraví se 6 inkubačních nádobek. 1,00 g vzorku (s přesností 0,1 mg) se naváží do 4 inkubačních nádobek. Zbývající dvě nádobky bez navážky vzorku se použijí pro slepý pokus (blank) pň stanovení bílkovin a při stanovení popela. Do každé nádobky se přidá 50 ml fosfátového nárazníkového roztoku (pH 6,0) a obsah se promíchá.
3.	Do všech nádobek se přidá 50 ml roztoku a-amylázy (Bioquant Merck) a směs se důkladně promíchá. Nádobky se přikryjí hliníkovou fólií a inkubují se 30 minut v lázni s vroucí vodou:
4.	Po ochlazení obsahu nádobek na teplotu místnosti se pH upraví na 7,5 (+ 0,1 ) za použití vodného roztoku NaOH (0,275 mol/l).
5.	Do nádobek se přidá 50 ml roztoku proteázy (Bioquant Merck), směs se promíchá, nádobky se přikryjí hliníkovou fólií a inkubují se při 60 °C po dobu 30 minut ve vodní lázni za stálého třepání. Doba inkubace začíná okamžikem, kdy obsah nádobek dosáhl 60°C.
6.	Směs je opět ochlazena na teplotu místnosti a pH se upraví na 4,5 ( +/- 0,2) pomocí vodného roztoku HCL (0,325 mol/1).
7.	Přidá se 150 ml roztoku amyloglukozidázy (Bioquant Merck), směs se promíchá, nádobky se překryjí opět hliníkovou fólií a směs se inkubuje 30 minut při 60 °C ve vodní lázni za stálého třepání (inkubace začíná tehdy, když obsah v nádobce dosáhne 60 °C).
8.	Rozpustná vláknina se srazí přidáním 280 ml etanolu (95 %), který byl předehřátý na 60°C (objem měřen před ohřevem). Obsah se promíchá.
9.	Předem zvážený kelímek s Celitem 545 se překlopí do inkubační nádobky a nasadí na zařízení FIBERTEC E. Po spuštění vývěvy je obsah nádobky s Celitem defiltrován přes fritu kelímku. Kapalný podíl se jímá do další inkubační nádoby umístěné ve spodní části filtračního modulu.
10.	Sraženina s celitem na kelímku se přemístí do druhé části filtračního zařízení. Za použití vakua se promývá 3 x 20 ml etanolu (78 %), 2 x 10 ml etanolu (95 %) a 2 x 10 ml acetonu.
11.	Zbytek v kelímku se suší přes noc při 150 °C v sušárně.
12.	Po ochlazení v exikátoru se kelímky zváží s přesností na 0, l mg. Odečtení váhy kelímku s Celitem dává hmotnost zbytku.

E. Stanoveni popela

Zbytek na dvou filtračních kelímcích (z původních čtyř navážek vzorků) a zbytek na jednom filtračním kelímku slepého pokusu se zpopelní v muflové peci při 525 °C. po dobu 5 hodin a poté ochladí v exikátoru a zváží s přesností na 0,1 mg.

Odečtením váhy skleněného kelímku s Celitem dostaneme hmotnost popela ve zbytku.

F. Stanovení bílkovin

Zbytek na dvou (ze čtyř filtračních kelímcích a zbytek na filtračním kelímku slepého pokusu se kvantitativně převede do destilačních trubic. Do každé trubice se přidá tableta katalyzátoru, 10 ml směsi kyseliny (H2SO4 : H3PO4 = 20 : 1 ) a 5 ml peroxidu vodíku.
Spalování probíhá ve spalovacím bloku DIGESTION SYSTEM 6 1007 Digester nebo v jiném zařízení se stejnými parametry. Trubice se umísti do bloku, nasadí se odsávací hlava, spustí se vodní vývěva a pak spalování.

Po spálení vzorku (kapalina je v trubici čirá) se trubice nechají v digestoři vychladnout (kapalina musí po ochlazení zůstat čirá - jinak je třeba vzorek dopálit).

Dokonale spálený vzorek se destiluje na destilační jednotce KJELTEC SYSTEM 1026 Distiling Unit nebo v jiném zařízení se stejnými parametry. Na počátku destilace se automaticky nadávkuje do tuby 50 ml 40 % roztoku hydroxidu sodného. Vydestilovaný amoniak se jímá do předlohy (60 ml 4 % vodného roztoku kyseliny borité a 5 kapek indikátoru Tashiro) a potom titruje 0,1 mol/1 kyselinou sírovou (vodní roztok). Ze spotřebovaného množství kyseliny a za použití faktoru pro přepočet dusíku na bílkovinu se spočítá obsah bílkovin ve vzorku.

Reprodukovatelnost metody je 64 až 100 %, v některých případech, zejména při vysokém obsahu vlákniny, může být i nižší.

G. Schéma analýzy

                                                        Vzorek (1,0 g) + 50 ml fosf. tlum. roztoku + 50 ul a-amylázy

	 inkubace 100 °C, 30 min.   ochladit   upravit na pH 7,5	
+ 50 ml proteázy		
	 inkubace 60 °C: 30 min.  ochladit  upravit na pH 4,5	
+ 50 ml amyloglukosidázy		
	 inkubace 60 °C, 30 min.	
srážení etanolem		
	 filtrace	
promývání etanolem 	 a acetonem	
	 sušení	

stanovení bílkovinstanovení popela		
určení celkové 	dietní vlákniny	

H. Výpočet

Výpočet TDF (váhová %):

% BLANK = mg blank.zbytku - 	% bílkovin v blank. zbytku + % popela v blank. zbytku	x mg blank.zbytku	
	 100		

mg bílkovin v blank. zbytku
 bílkovin v blanku zbytku = x 100 mg zbytku blan u
mg popela v blank. zbytku
% popela v blanku zbytku = x 100 mg zbytku blanku
% bílk zbytku vz. + popela ve zbytku vz.
mg zbytku vz. - x mg zbytku - BLANK 100
% 6 TDF = 
mg vzorku x 100
mg bílkovin ve zbytku vzorku
% bílkovin ve zbytku vz. = r x 100 mg zbytku vzorku
	mg popela ve zbytku vzorku
% popela ve zbytku vz. = x 100 mg zbytku vzorku